人类Rab7多克隆抗体的获取

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人类 Rab7 多克隆抗体的获取

Rab 蛋白是小分子 GTP 结合蛋白家族 (由Ras、Rho/Rac/Cdc42、Ran、Sar/Arf、Rab 等亚家族组

成)中最大的亚家族,由Novick 等于 1980 年首先发现.研究表明,Rab 存在于所有的真核生物中,在

进化过程中高度保守,但在不同物种中又表现出数量和功能多样性.目前,在人类已发现约 70 种

Rab 蛋白和 Rab 样蛋白.

Rab 蛋白由 200 个左右的氨基酸组成,是一种单体形式的 GTP 结合蛋白.Rab 蛋白由保守的 G结

构域和高度可变的 N端和 C端组成,其家族成员的氨基酸序列的相似性在 35%~80%之间.Rab 蛋

白在体内有两种构象:与GTP 结合的 Rab 蛋白处于活化的状态,位于胞膜;未活化的 Rab 蛋白与

GDP 结合,位于胞浆.

作为囊泡运输的分子开关,Rab 蛋白在非活化和活化状态之间不断转换,在囊泡的形成、转运、

粘附和融合过程中起重要作用.Rab 蛋白可直接或间接与被运输的分子结合,使其进入囊泡.

Rab 蛋白能聚集于细胞内特定的膜区,通过吸附不同的效应因子而实现与靶膜的结合.

最近几年的研究表明,一些 Rab 蛋白通过囊泡运输参与细胞内信号传导,调节细胞的增殖、分化

和凋亡,而有些 Rab 蛋白甚至直接影响 DNA 的复制与转录.

Rab7 属Rab 蛋白家族,在早期内体到晚期内体以及晚期内体到溶酶体的膜泡转运中发挥重要的

作用.

本论文将人类 Rab7 基因克隆到原核表达载体,通过诱导基因工程菌获得 Rab7 蛋白,并以此为抗

原免疫小白鼠,获得人 Rab7 多克隆抗体,为进一步研究 Rab7 的生物学功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

Tripure Isolation Reagent 购自 Roche 公司,M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 为TaKaRa 公司产

品,质粒 DNA 提取试剂盒和胶回收试剂盒购自 Omega 公司,Glutathione Sepharose

4B、ProteinAagarose 购自 GE 公司,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自 Sigma 公司,表达

质粒 pGEX-4T-2 和大肠杆菌 DH5α 菌株由本实验室保存, 引物

1:5’AAGGATCCATGACCTCTAGGAAGAAAG 3’(BamHI)和引物

2:5’AAGAATTCGCAACTGCAGCTTTCTGCC 3’(EcoRI)由生工上海有限公司合成,Taq DNA 聚

合酶、dNTP、EcoRⅠ 酶、BamHⅠ 酶、T4DNA 连接酶、蛋白质标准marker 购自

Ferments,DNA marker 购自上海生工,其他试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 人肾胚细胞 HEK293RNA 的提取与逆转录将培养瓶中培养的 HEK293 细胞吸去培养基,直

接加入 1mL 的Tripure,吹打几次使细胞完全裂解,然后转入 1.5mL 的Ep 管中,根据使用说明提取

总RNA,然后用50μL 的经DEPC 处理的灭菌去离子水溶解.取4μg 总RNA,根据 M-MLV

ReverseTranscriptase 的说明进行逆转录获得 HEK293 细胞的 cDNA.

1.2.2 Rab7 基因的重组表达常规方法扩增Rab7 基因,PCR 扩增条件为:94 ℃预变性 3min,94 ℃变

性30s,58℃退火 30s,72℃延伸 45s,共38 个循环,再于72℃继续延伸 10min.PCR 产物经琼脂糖凝

胶电泳检测后,回收目的片段.

用EcoR I,BamH I 酶切PCR 产物和 pGEX-4T-2 质粒,然后回收酶切产物,在24℃下用T4DNA 连

接酶连接 30min,连接产物转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞,涂到含氨苄青霉素的LB 固体培养

基平板上培养 16h,菌落PCR 方法挑选阳性克隆,PCR 条件同上.

选取阳性克隆培养,提取质粒,通过双酶切法进一步检测,阳性菌落送生工测序.

检测与测序正确的菌株接种到 5mL 含氨苄青霉素的LB 液体培养基中,37 ℃下振荡培养过夜,第

二天按 1 50∶的比例接种到新鲜的培养基中培养至生长对数期(约4h)后取出,放至室温后加入诱

导剂异丙基-β-D-硫代半苷(IPTG),诱导剂的终浓度为 0.25mmol/L 的,然后将不同的菌液分别在不

同温度下继续摇培4~6h 进行目基因的诱导表达.

离心法收集菌体,菌体用冰冷的PBS 重悬,超声破碎裂解细菌,10 000× g 离心 10min,对离心后的上

清和沉淀进行SDS-PAGE 电泳分析.

1.2.3 Rab7 重组蛋白的纯化将含重组质粒的 DH5α 菌接种于 500mL LB 液体培养基,加入 IPTG 后

在24℃继续摇培6h.离心收集菌体,加入预冷的15mL 1×PBS 缓冲液,冰上超声裂解细菌.裂解液

4℃下10 000× g 离心 20min,将离心后的上清液与Glutathione Sepharose 4B 结合 30min,将结合液

装到层析柱上,用1×PBS 洗去杂蛋白,然后用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,10mmol/L

GSH,pH8.0)洗脱目的蛋白.通过 SDS-PAGE 法鉴定融合蛋白的纯度,用Bradford 法测定蛋白质浓

度.

1.2.4 Rab7 多克隆抗体的制备取抗原 200!g,加入弗氏完全佐剂(后3次用不完全佐剂)振荡混合

4~6h 至抗原完全乳化.选取10 只7~12 周的BALB/c 雌鼠进行免疫注射,共注射 4次,每次间隔

10d.最后一次注射后第 4天采血,用1.5mL Ep 管收集鼠血,放置在4 ℃冰箱中过夜.第二天,4 ℃ 2

000g 离心 10min,吸取血清,分装成小管放在-80℃冰箱中保存.使用时用Protein A agarose 亲和柱

分离抗血清中的 IgG.

1.2.5 酶联免疫分析(ELISA)设置正常处理(抗原+抗体+二抗)、阳性对照(稀释二抗+底物溶液)、

阴性对照(抗原+其他小鼠抗体+二抗)三组反应,按ELISA 法常规操作,鉴定Rab7 多克隆抗体的特

异性和滴度.

2 结果与分析

2.1 Rab7 基因的克隆与表达从NCBI 获得 Rab7(NM_004637.5)基因的 cDNA 序列,以HEK293 细

胞的总RNA 逆转录出来的cDNA 为模板,用Rab7 基因的特异性引物扩增,扩增产物通过 1.2%的

琼脂糖凝胶电泳检测,可以在凝胶上看到600bp 左右的条带,与预想的PCR 产物大小相符合.PCR

产物经常规的操作步骤,构建出重组质粒 pGEX-4T-2-Rab7,然后转化大肠杆菌 E.coli DH5α 感受

态细胞,菌落PCR 扩增出与预期结果大小一致的特异性条带(图1).【图 1】

对该重组表达质粒进行双酶切鉴定,也得到一条长约600bp 的条带,与预期大小一致,说明Rab7 基

因已克隆到表达载体上,对酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序,使用 DNAMAN 软件比较此次克

隆到的序列和 NCBI 上的序列,结果表明序列结果正确,没有移码或突变,表明原核表达载体成功

构建.SDS-PAGE 电泳结果表明,经IPTG 诱导表达的重组菌出现一条非常明显的诱导蛋白条带,

条带大小在 48kDa(图2,箭头所示),此带的大小与 Rab7 蛋白及与其融合的 GST 蛋白的分子量

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摘要：

人类Rab7多克隆抗体的获取Rab蛋白是小分子GTP结合蛋白家族(由Ras、Rho/Rac/Cdc42、Ran、Sar/Arf、Rab等亚家族组成)中最大的亚家族,由Novick等于1980年首先发现.研究表明,Rab存在于所有的真核生物中,在进化过程中高度保守,但在不同物种中又表现出数量和功能多样性.目前,在人类已发现约70种Rab蛋白和Rab样蛋白.Rab蛋白由200个左右的氨基酸组成,是一种单体形式的GTP结合蛋白.Rab蛋白由保守的G结构域和高度可变的N端和C端组成,其家族成员的氨基酸序列的相似性在35%~80%之间.Rab蛋白在体内有两种构象:与GTP结合的Rab蛋白处于活化的状态,...

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